Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả lý trích DNA từ lông

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

BÙI THỊ NGỌC BÍCH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2006, “SỬ
DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ
LÔNG”.
Hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Trần Thị Dân
2. KS. Nguyễn Văn Út

Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 tại
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Trong các thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng mẫu máu, da,
cơ để ly trích DNA. Tuy nhiên, nhiều khi ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ
trong khoa học hình sự hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm.
Ngoài ra, thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác trên thú sống. Với
mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, đề tài đƣợc
tiến hành trên lông bò và lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD
của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính và
đoạn mồi phát hiện gen halothane.
Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
1. Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca
2+
ở

các nồng độ 2 mM, 6
mM và 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm
PCR từ DNA của gốc lông bò khi ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca
2+
cho 1
băng dài 370 bp của gen giới tính.
2. DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không có sự khác biệt
nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng .
3. DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm
lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông (1,2).
4. DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh
sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58).

v

5. Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích có ảnh hƣởng đến độ tinh sạch
của DNA. Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao nhất (1,84 ); 0,06% CTAB cho
OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3.
6. Sử dụng BSA cũng không có tác dụng trong việc cải thiện kết quả PCR
vì không nhân đƣợc đoạn DNA 655 bp của gen giới tính.
Nhìn chung, các hoá chất đƣợc bổ sung vào quy trình ly trích DNA và hỗn
hợp PCR chỉ cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà không có đoạn DNA dài
(655 bp) của gen giới tính. Đồng thời, các thí nghiệm đều không cho kết quả mong
muốn khi PCR phát hiện gen halothane trên 5 mẫu lông heo.

vi

MỤC LỤC

TRANG
Lời cảm ơn 1
Tóm tắt khóa luận iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình và biểu đồ x
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1
1.2.1. Mục tiêu 1
1.2.2. Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Cấu trúc tổng quan của lông 3
2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo 3
2.3. Cấu trúc của melanin 4
2.4. Cấu tạo của keratin 5
2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông 5
2.6. Nguyên tắc của PCR 7
2.7. Nguyên tắc xác định gen giới tính và gen halothane 9
2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính 9
2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane 9
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1. Nội dung nghiên cứu 11
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 11
3.3. Vật liệu 11
3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 11
3.3.2. Đoạn mồi 11
3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính 11

vii

3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane 12
3.4. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 12
3.4.1. Lấy và trữ mẫu 12
3.4.2. Tách chiết DNA 12
3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích 15
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 15
3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính 15
3.4.4.2. PCR xác định gen halothane 16
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 17
3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 17
3.4.5.2. Kết quả điện di PCR 17
3.5 Xử lý số liệu 17
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca
2+
trong dung dịch đệm ly trích DNA 18
4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò 19
4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò 20
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích
DNA 21
4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin 23
4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR 23
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25
5.1. Kết luận 25
5.2. Đề nghị 25
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
PHỤ LỤC 28








viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp base pair
ctv cộng tác viên
DNA deoxyribonucleic acid
NST nhiễm sắc thể
OD optical density
DTT Dithiothreitol
CTAB Cetyltrimetylamonium bromide
BSA bovine serum albumine
PCR polymerase chain reaction
Taq thermus aquaticus
Tỷ số OD tỷ số OD
260 nm
/OD
280 nm

UI unit
UV ultra violet
W wave


ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

TRANG
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính 12
Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính 15
Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính 16
Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane 16
Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane 17
Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với các nồng độ Ca
2+
18
Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò 19
Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò 19
Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông 21
Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT 22
Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mức CTAB 23
Bảng 4.6 Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung 24

















x

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

TRANG
Hình 2.1 Chu kỳ đầu tiên trong PCR 7
Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR 8
Hình 4.1 Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca
2+
19
Hình 4.2 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò 20
Hình 4.3 Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò 21
Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT 22
Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu sử dụng và không sử dụng BSA 24


Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca
2+
18
Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò 19
Biểu đồ 4.3 Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò 21
Biểu đồ 4.4 So sánh DNA ly trích bởi dung dịch đệm có DTT và không có DTT 22
Biểu đồ 4.5 Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB 23



1


PHẦN I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều
ngành khoa học nhƣ chăn nuôi, thực vật, thực phẩm Áp dụng kỹ thuật gen trong
nghiên cứu di truyền đã làm tăng cấp độ và hiệu quả của việc cải thiện cây trồng và
chăn nuôi. Một điều kiện tiên quyết để đạt ƣu điểm của những phƣơng pháp này là khả
năng tách chiết và tinh sạch DNA đạt yêu cầu số lƣợng và giữ nguyên cấu trúc.
Sự phát triển của những phƣơng pháp tinh sạch DNA hiệu quả từ nhiều nguồn
mẫu khác nhau là mối quan tâm đối với những phòng thí nghiệm mô hình mẫu. Công
việc này đang là thử thách đối với những vật liệu chứa một hàm lƣợng lớn
polysaccharide hay những chất thứ cấp nhƣ polyphenol, terpene, resin…
Tách chiết DNA từ máu, thịt rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các
mẫu này thƣờng đƣợc dùng cho hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, các nguồn mẫu
khác nhƣ lông, da, xƣơng… cũng cần đƣợc quan tâm. Loại mẫu này thƣờng chứa
lƣợng DNA ít, nhiều protein và chất hữu cơ nên việc ly trích trở nên khó khăn khi
muốn tinh sạch và có đủ lƣợng DNA cho bất kỳ phân tích nào.
Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ
thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng
pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay
đối với mẫu lông là lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết
không đặc hiệu. Do đó hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí
nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có
thể đƣợc tạo sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh, và có thể đƣợc thƣơng mại
hóa vì vấn đề này vẫn còn đang bỏ ngỏ.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Đánh giá ảnh hƣởng của một số hóa chất trong quy trình tách chiết DNA từ
lông, trên cơ sở hoàn thiện quy trình ly trích và tạo bộ kit ly trích lông sau này.


2


1.2.2. Yêu cầu
- Thay đổi quy trình tách chiết DNA từ lông heo, bò bằng cách bổ sung canxi,
DTT, CTAB trong dung dịch đệm ly trích, và bổ sung BSA trong hỗn hợp PCR.
- Kiểm tra hiệu quả quy trình tách chiết thông qua đo OD và phản ứng PCR với
gen mục tiêu là giới tính (trên bò) và halothane (trên heo).



























3



PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cấu trúc tổng quát của lông
Theo Hairhandout (2005), lông có 3 vùng hình thái học: lớp cutin, vỏ, lõi.
- Lớp cutin: là 1 lớp mờ bên ngoài của thân lông chứa những vảy bao lấy
thân. Có 3 cấu trúc vảy cơ bản tạo lên lớp cutin – vòng hoa, cánh hoa, mái ngói.
- Lớp vỏ: là thân chính của lông chứa những tế bào thon dài và mảnh. Nó
chứa cortical fusi, hạt sắc tố, và / hoặc những cấu trúc có hình dạng từ bầu dục đến
hình tròn lớn gọi là thân hình trứng.
- Lõi: là trung tâm của những tế bào có thể hiện diện trong lông.
Thành phần cơ bản của lông là keratin (1 loại protein), melanin (1 loại sắc tố),
và 1 lƣợng rất nhỏ nguyên tố kim loại.
2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo
Theo Wagner và ctv (1996), lông không chỉ bao gồm thân lông chết nhìn thấy
bên ngoài da mà còn bao gồm phần gốc đang phát triển trong da. Phần gốc nằm trong
da đƣợc bao quanh bởi bao gốc lông, để lộ ra cấu trúc phức tạp và khác nhau. Cấu trúc
này thƣờng đƣợc tìm thấy trong tất cả động vật có vú.
Tại phần đế của lông có hình dạng nhƣ chuông (hành lông), bao quanh là một
nhú da nhỏ, hình dạng này phụ thuộc vào lớp biểu bì hình ngói của da. Chức năng của
hành lông là dinh dƣỡng cho những tế bào đang phát triển của lông. Những tế bào gần
nhú lông không khác nhau và là vùng tái sinh của lông, bao gồm cả bao gốc. Phụ thuộc
vào vị trí của chúng trong hành lông, những tế bào đƣợc tạo ra sau trong vùng này
khác nhau về những loại tế bào mà nó sẽ tạo ra lông và mô xung quanh nó. Mô này
chứa năm lớp đồng tâm khác nhau, ba lớp trong cùng hợp thành bao gốc trong cùng
(inner root sheath – IRS). Tiếp xúc trực tiếp với lớp cutin của lông là cutin của IRS
(IRS – cutin), tiếp theo là hai lớp, lớp Huxley và lớp Henle. Lớp kèm (companion
layer – CL) là lớp tiếp theo bên trong bao gốc. Lớp này cũng đƣợc gọi là lớp trong
cùng của bao gốc bên ngoài (outer root sheath – ORS) hay bao gốc giữa. Lớp ngoài
cùng của bao gốc là ORS, bao quanh bởi những lớp khác nhau và lông. Lớp ORS

Xem chi tiết: Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả lý trích DNA từ lông